Trafic intracellulaire et glycosylation de l'hydroxyproline

Rapports scientifiques volume 13, Numéro d'article : 13506 (2023) Citer cet article

355 accès

1 Altmétrique

Détails des métriques

Il a été démontré que l’expression de protéines recombinantes dans les cellules végétales avec un peptide hydroxyproline (Hyp)-O-glycosylé (HypGP), tel que des répétitions en tandem d’un motif « Ser-Pro », augmente les rendements en protéines sécrétées. Cependant, une sécrétion spectaculaire et une hyp-O-glycosylation des protéines marquées par HypGP ne peuvent être obtenues que lorsque les cellules végétales ont été cultivées dans un milieu SH déficient en azote. Seules des traces de protéine de fusion sécrétée ont été détectées dans le milieu MS. Cette étude vise à mieux comprendre le mécanisme possible sous-jacent à ces résultats en examinant le trafic intracellulaire et l'hyp-O-glycosylation d'une protéine fluorescente verte améliorée (EGFP) fusionnée avec une étiquette (SP)32, composée de 32 répétitions d'un " Motif "Ser-Pro", en cellules tabac BY-2. Lorsque les cellules ont été cultivées dans un milieu MS, le (SP) 32-EGFP a formé un agrégat protéique semblable à un corps et a été retenu dans le RE, sans subir de Hyp-O-glycosylation. En revanche, la protéine de fusion devient entièrement hyp-O-glycosylée, puis sécrétée dans le milieu SH. L'analyse du transcriptome des cellules BY-2 cultivées dans un milieu SH par rapport à un milieu MS a révélé plus de 16 000 DEG, avec de nombreux DEG régulés positivement associés au mouvement basé sur les microtubules, au mouvement du composant subcellulaire et à la liaison des microtubules. Ces DEG sont vraisemblablement responsables du transport amélioré ER-Golgi des protéines marquées par HypGP, permettant leur glycosylation et leur sécrétion dans le milieu SH.

La cellule végétale est devenue une puissante plate-forme de bioproduction de protéines pharmaceutiques recombinantes, car elle offre des avantages en termes de sécurité et de rentabilité par rapport aux autres organismes eucaryotes1,2,3. Semblables aux cellules de mammifères, les cellules végétales sont cultivées dans un environnement stérile et contrôlé et le GMPc peut être facilement mis en œuvre tout au long du pipeline de production. Au cours des deux dernières décennies, des progrès substantiels ont été réalisés dans l’amélioration du système de culture de cellules végétales, aboutissant à quelques cas de réussite commerciale. Notamment, le médicament orphelin approuvé par la FDA, Elelyso®, est une enzyme thérapeutique produite par des cellules végétales (glucocérébrosidase) pour le traitement de la maladie de Gaucher, qui est devenue la première protéine pharmaceutique fabriquée à partir de cellules végétales au monde à être utilisée chez l'homme4,5. Malgré cette avancée majeure, plusieurs défis techniques limitent les applications commerciales généralisées de cette plateforme. Le défi le plus important est la faible productivité, avec des rendements en protéines allant de 1,0 µg/L à 10 mg/L6,7,8. De plus, la protéine d’intérêt a tendance à s’accumuler au niveau intracellulaire, ce qui entraîne une augmentation des coûts de purification des protéines.

Ces défis techniques ont été récemment résolus par une technologie exclusive, appelée ingénierie HypGP, qui implique l'expression d'une protéine recombinante fusionnée avec une étiquette peptide hydroxyproline (Hyp)-O-glycosylé (HypGP), qui peut se présenter sous la forme de répétitions en tandem d'un Motif « Ser-Pro » ou un motif « Ala-Pro », noté (SP)n et (AP)n (n = 5, 10, 20, 32). L'étiquette HypGP pourrait fonctionner comme un support moléculaire en favorisant le transport efficace des protéines conjointes dans les milieux de culture. En conséquence, cette technologie a considérablement augmenté les rendements sécrétés de plusieurs protéines recombinantes dans les cultures de cellules végétales9,10,11,12,13 et de microalgues14. Cependant, il a été découvert que la sécrétion et l’hyp-O-glycosylation des protéines marquées par HypGP dans les cellules végétales étaient fortement affectées par la composition du milieu de culture15. Remarquablement, des protéines entièrement glycosylées marquées par HypGP ont été sécrétées en grande quantité lorsque des cellules BY-2 ont été cultivées dans un milieu Schenk et Hildebrandt (SH) déficient en azote, ce qui a entraîné une faible accumulation de biomasse cellulaire. En revanche, une petite quantité de protéine sécrétée a été détectée lorsque des cellules BY-2 ont été cultivées dans un milieu Murashige et Skoog (MS) riche en azote16, favorisant une croissance cellulaire rapide et une accumulation élevée de biomasse. Dans les deux cas, les protéines intracellulaires marquées par HypGP sont restées non glycosylées9,15,17,18. Il est intéressant de noter que lorsque les protéines marquées par HypGP étaient exprimées dans des plantes entières (Nicotiana tabacum et Nicotiana benthamiana), la plupart des protéines synthétisées restaient non glycosylées 17,19.